Перспективные флуоресцентные красители для in vitro и in vivo применений

Благодаря развитию высокочувствительных методов визуализации широкое распространение получили исследования, основанные на детекции флуоресценции in vitro и in vivo. Флуоресцентные методы позволяют решать такие задачи, как детекция единичных молекул и отдельных клеток; визуализация субмикронных объектов в молекулярной биологии с помощью флуоресцентной микроскопии; подсчет клеток, их сортировка и детектирование биомаркеров; а также могут использоваться для поиска заданных молекул, например, при изучении окислительного стресса клеток, определении уровня монооксида азота in vivo, иммунологического анализа, детекции амплификации в ПЦР реального времени и геномного секвенирования.

Флуорофоры на основе бордипиррометена (BDP) занимают особое место среди органических флуоресцентных красителей благодаря сочетанию ценных свойств. Они характеризуются высокими квантовыми выходами флуоресценции, в том числе и в водной среде; узкими полосами поглощения и флуоресценции, что дает возможность четко детектировать сигнал; высокой фотостабильностью.

В настоящее время на рынке представлены десятки флуоресцентных красителей различных фирм на основе BDP в активированной форме. Все они характеризуются низкой гидрофильностью и, вследствие этого, обладают склонностью к образованию надмолекулярных комплексов в водной среде, что приводит к искажению результатов исследований, а также к трудностям при получении конъюгатов красителей с биомолекулами.

Исследования, направленные на получение водорастворимых флуоресцентных красителей, а также красителей с высокой фотостабильностью и яркостью флуоресценции, представляют собой актуальную научно-техническую задачу.

Компания «Биотех-Инновации» инициировала исследования по созданию в России такого рода флуорофоров. К настоящем моменту завершены два этапа исследований. На первом этапе были создан ряд структур бордипиррометеновых красителей, характеризующихся высокой гидрофильностью/фотостабильностью. По фотофизическим характеристикам (стоксов сдвиг шире в 2 раза, в квантовом выходе потери энергии снижены в 2-10 раз, коэффициент экстинкции увеличен на 20%, фотостабильность увеличена до 4 раз) синтезированные в ходе работы производные BDP для наиболее популярного флуоресцеинового канала превосходят коммерческие аналоги (BODIPY FL).

BODIPY FL

Сравнение Стоксовых сдвигов (разница между максимумами поглощения и флуоресценции) синтезированного и контрольного красителей

BODIPY FL карбоновая кислота



Краситель BDP с сульфогруппами и арильным заместителем

Окраска красителя BDP с сульфогруппами и арильным заместителем (справа) и его флуоресценция (слева)

Особенность структуры таких красителей – в уменьшении числа метильных заместителей в бордипиррометеновом ядре, наличии сульфогрупп, а также специфический арильный заместитель.

На втором этапе разработаны реакционноспособные производные этих красителей (азиды, алкины – для конъюгации в реакциях клик-химии и N-гидроксисукцинимидильные производные – для конъюгации с аминогруппами), доказано их эффективное химическое взаимодействие с молекулами олигонуклеотидов и белков, тем самым подтверждена возможность их практического применения для модификации биологических молекул и дальнейшего усовершенствования до коммерческих продуктов. Также к внедрению в коммерческую практику разработан ряд продуктов для каналов красителей с большей длиной волны поглощения, чем у флуоресцеина (495 нм):

  • FKP-BDP, алкин и азид, для канала красителя R6G;
  • TF-BDP, алкин, азид и гидроксисукцинимидный эфир для канала 590 нм;
  • FB-BDP, N-гидроксисукцинимидный эфир и малеимид (конъюгация с SH-группами белков), для канала 581 нм;
  • MF-BDP, N-гидроксисукцинимидный эфир, алкин и малеимид для канала красителя TAMRA;
  • TFE-BDP, малеимид, для канала 630 нм.

Окраска (вверху) и флуоресценция (внизу) красителей ряда BDP, от канала флуоресцеина (крайний справа) до канала 630 нм (крайний слева).

В настоящий момент данные флуорофоры коммерчески доступны по запросу. Дистрибуцией нашей продукции в Европе занимается германская компания Lumiprobe GmbH (23 Feodor-Lynen-Strasse, 30625 Hannover, Germany, order@lumiprobe.com).

Исследования ведутся при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, в рамках проекта «Превосходящие мировой уровень флуоресцентные метки для диагностических применений in vitro и in vivo».